生物時計って何？

哺乳類の生物時計、視交叉上核 １．日常生活でのリズム 私達は毎日の生活の中で、自分の体内の状態が２４時間周期で変動していることに気づくことはあまりないかもしれない。しかし例えば血圧を一日２４時間にわたって途切れることなく測定し続けると１）、午後の血圧は朝の起床時に比べると実に６０mmHgも高くなっている人が見つかっている。午後の血圧だけから判断すると高血圧症ということになるが、一日の平均ではそれほど高くない。この結果は血圧は一日一回測るだけでは不充分なことを表している。この人の日内変動の大きさはかなり例外的であるが誰でも多かれ少なかれ昼と夜の血圧は違っているものである。 例えば心臓発作やぜん息の発作、それに身近な例では偏頭痛の始まりなどはみな朝方に集中している。個人差は小さくないが統計を取ってみると明らかに心臓発作は起床後１～２時間以内に起こり、ぜん息の発作は起床前に始まる確率が有意に高い２）ことがわかっている。このように自分達が意識するかしないかに関らず私達の身体の生理的状態は一日周期で大きく変動し、それによって私達の能力も一日周期で上下している。だから朝より午後の方が力を出せるし、速く走れることは誰もが知っていることであろう。 ２． 地球で進化してきた生物 ここまで述べてきたような私達の身体の機能の日内変動は実は人間だけに見られるものではなく地球上の生物全般に広く見られる一般的性質である３）。例えば蚊が蚊柱を作って大群を成して飛ぶのはいつも夕方である４）し、リスは昼間餌を捜して歩き回るが、夜は巣の中で過ごす。鳥も昼間は巣を離れ、夜は巣に戻ってくる生活を規則正しく実行している。植物も例外ではなくミモザの葉は昼は葉を拡げ夜は葉をすぼめるし、海に漂う発光藻の一種ゴニオラックスは夜発光するが、昼は光を発することはできない。そして実験室で明暗も温度も全く変わらない条件に置かれた生物もやはり日内変動を示す。これは単細胞の藻類から人間まで共通した性質である。このことは生体が外界の環境周期とは別に一日をはかる仕掛けを生体内に持っていることを意味している。この仕組の存在は生物が２４時間で自転する地球で誕生し、長い時間をかけて進化してきたことを証明しているものである。 ３．光によるリズムの調整 もう一つどんな生物にも共通なことはこの恒常条件における一日の繰り返しが正確に２４時間にはならないと言うことである。人間の場合、人にも依るがその周期は約２５時間と言われている。そこで疑問が湧く。もし人間の本来の周期が２５時間なら、一日１時間ずつ地球の自転で決められる一日とずれていき、２週間で夜起きて昼間は寝る生活になり、更に２週間で元に戻ることになりやしないかということである。実際、人間に環境変化の全くない洞窟や宇宙で生活してもらったりするとそうなる。ところが、日常生活ではそうはならない。それは環境の明暗周期がが毎日１時間ずつ人間の時計を進めているからなのである。生物の時計機構はいわば自動的に光によって時刻を修正する装置を併せ持っていることになる。人間の赤ちゃんがいつ寝ていつ起きたかを生まれて２週目から２６週目まで記録した有名な実験があるが、赤ちゃんが生まれてからしばらくすると起きている時間が少しずつ集合してくるが、８週目から１５週目ぐらいまでは起きている時間が図の上で右へ流れていくように見える。これは赤ちゃんの時計が２４時間より長い周期でフリーランしていることを表している。１５週目ぐらいから活動期が昼間に止まって流れなくなる。これは、この頃から赤ちゃんは光を感じるようになり、それによって体内の時計を毎日修正できるようになるからである。 ４．実験動物のリズム さて私達はこのような日周変動の基礎にある生体内のメカニズムを追究してきた。ラットやハムスターといった実験動物は非常にはっきりした活動のリズムを示す。この例ではこの動物にとっての一日は２３時間５５分だが、それを１日１分の違いもなく認識できることを示している。１分としてもその誤差は1/1435であるから、驚くべき正確さで一日を知ることができると言ってもよい。この実験動物をモデルに使って我々はリズムの本質的メカニズムを追求している６）。 ５．脳の視交叉上核 光によって周期が正確に２４時間に合わせられるのであるから、このリズムの発信源には光の情報が伝えられているに違いない。哺乳類では光は眼でしか知覚されない。そこで視神経の経路を追いかけることによって、サーカディアンリズムの発信源が見つけられるはずである。実際生物時計の中枢である視交叉上核はこうして発見された７）。 生物時計の座であり生物に昼と夜の違いをもたらす場所である視交叉上核は、脳の一番奥深い場所にあるせいぜい一万個の神経細胞とグリア細胞から成るちっぽけな細胞集団である。ここに本質的な生物時計の機能がすべて集約されていることを私達の研究室の実験成績で述べる。まず脳に電極を挿し入れて通電し、視交叉上核の機能を停止させてしまうと昼間も夜間も同じように行動し昼と夜の区別がなくなってしまう。この結果は視交叉上核が個体のリズムに重要なことを示す最初の発見となった。 しかし機能を停止させてしまったのではそこで何が起こっているのか解析できないので次に神経細胞の活動を記録した。神経細胞は電気のインパルスを伝え合って活動しているので、視交叉上核の活動はこのインパルスの数を数えて評価した８）。視交叉上核の細胞は平均してみると昼間は活動が高くなり夜はほとんど静かになってしまう。それは、まるで数学の三角関数のような正確さで視交叉上核はリズムを作っていた。ところがこのような美しさはないのだが、ラットの脳ではどこでも多かれ少なかれ電気活動が日内変動していることも見つけられた９）。それはラットの脳もまた夜主に活動していることからくる当然の事実であるが、これでは２４時間リズムの発信源がどこにあるかを確定的に言うことはできなくなってしまった。 視交叉上核の自律リズム そこで次に、視交叉上核の入力と出力線維の連絡を外科的な方法で切った状態にして電気活動のリズムに何が起こるかを見てみた。もしも２４時間リズムが視交叉上核から発しているのだとすれば、視交叉上核の入力を外科的に切り離しても、尚、視交叉上核の電気活動に２４時間リズムが見られるはずである。結果は実際その通りであった７）、１０）。入力なしでも相変わらずはっきりした昼夜変動を示す視交叉上核とは対照的に、行動上もまた脳の視交叉上核以外の場所で見られたリズムも完全に消失してしまった。この成績は脳の日周変動が視交叉上核のリズムによってもたらされていることを示している。そしてこの視交叉上核のリズムは恒常条件でも継続した。 ６． 生体外に取り出された視交叉上核 先の実験は視交叉上核がリズムを作り出す能力を持っていることをかなり決定的に証明したものであるが、それでも切り離された組織は脳の中にあり、血流を通じての相互作用や神経の再生などの可能性などがあって疑いを捨てきれない人もいた。そこで我々は生まれたばかりのラットの脳から視交叉上核組織を培養ディッシュの中に取り出し生体外でも尚この視交叉上核のリズム生成機構が動いている証拠を得ることが最近できた１１）。培養視交叉上核の培養液中に放出されるバソプレシン(AVP)と呼ばれるペプチドの量を４時間ごとに測定したところ、明らかに２４時間に近い周期で放出量が増加することがわかった。 いったい一万個ほどの神経細胞からできている視交叉上核の中でどのような仕掛けが働いて約一日のリズムが作られているのだろうか。 ７．視交上核のペプチド この２４時間リズムを生成するという、脳の機能としてもユニークなメカニズムはどのようにして働いているのであろうか。この核の細胞構成を調べた沢山の仕事によれば１２）視交叉上核の細胞は多くのペプチドを生産していることがわかっている。総じて脳の奥底の場所はペプチドの豊富な場所であるが、室傍核や視索上核などに次いで視交叉上核にも多種類のペプチドが高密度で分布している。そこでこれらのペプチドが視交叉上核の主な機能であるリズム生成機構に含まれている可能性を検討してみた。 まずバソプレシンについて視交叉上核組織に含まれる量を４時間おきにサンプリングし、酵素抗体法で測定した。バソプレシンに限らずこの後出てくるソマトスタチン、VIP、GRPなどのペプチドは皆、初めはそのホルモン作用から発見されたものであるが、視交叉上核で合成されるペプチドは血中に放出されるわけではなく、むしろ電気活動に伴ってシナプス間隙に放出され、隣り、または周辺の細胞を刺激か抑制する神経伝達物質か、あるいは細胞の反応性を変える神経伝達調節物質としての役割が考えられている。視交叉上核のバソプレシン含量は、恒暗条件下でも日周変動しており、光がつく筈の時刻から数時間後に最大値を示し、夜に当たる時刻には低い値に止まっている１３）。このようなバソプレシンの日周変動は動物を明暗条件下に移してもほとんど同じパターンで観察される。このことはバソプレシンは、内因性に動いているペースメーカー機構即ち生物時計の影響下にあって、光の直接の作用は受けていないことを意味している。バソプレシンは視交叉上核の中でも背内側部に合成する細胞が集まっているペプチドであるが、バソプレシンと同様背内側部にある細胞によって合成されるソマトスタチンもほとんど同じ２４時間パターンを描いた１４）。バソプレシンとソマトスタチンは全く別の遺伝子から合成される異なるペプチドであるから、この一致は何か共通の制御機構が働いていて日周変動が生じていることをうかがわせる。またバソプレシンもソマトスタチンも背内側部で作られるペプチドであるからこの結果は背内側の細胞が脳の他の場所へ生物時計の影響を伝える役割を果たしていることを示しているのかもしれない。 ８．視交叉上核のmRNA 一般にペプチドの量を制御しているのは合成と分解のバランスである。まず合成について考えると、ペプチドは遺伝子から細胞内のタンパク合成機構によって生産され、その合成能力を決めているのがメッセンジャーRNA（mRNA）の量だと考えられている。そこで視交叉上核におけるソマトスタチンを作るmRNAの量の変動を調べて見た１５）。バソプレシンのmRNAにも興味はあるがバソプレシンを遺伝的に欠いたラットでもリズムがあることからバソプレシンが生物時計の構成分子ではないかという考えには多くの人が否定的である。 ソマトスタチンmRNAも恒暗条件下でやはり３倍にも及ぶ大きな変動を示していた。その時間変化はソマトスタチンペプチドの場合より明らかに２、３時間早く変動していた。このことが意味するところは未だ明らかではないがソマトスタチンのmRNAの量がソマトスタチンペプチドの合成率を反映しているとすれば、合成が盛んになるとそれに少し遅れて全体量が増え、合成が減るとそれに少し遅れて全体量が減ってくることになってつじつまがあうように思われる１６）。一方、細胞全体の電気活動のリズムと比較すると電気活動のリズムはペプチドのリズムより更に数時間遅れて変動していることがわかる。ペプチドが合成されてから細胞の電気活動が高まる迄に何が必要なのだろうか。この答えも未だ得られていない。もっとも私達は単に１つのペプチドの量を決定しただけで、完全な細胞活動に必要な沢山の分子がどう時間的に変化ているのか全く知らない訳であるから、今は説明できなくても仕様がないかもしれない。 さて、バソプレシンもソマトスタチンも視交叉上核の背内側部にあり恒暗条件で光が点くはずの時刻より３～４時間後に最大になるようなリズムを示し、光に対しては直接は応答しないことを示した。これはバソプレシンとソマトスタチンが生物のリズム生成機構の支配下にあってその量がコントロールされていることを意味している。だから本当に関心のあるリズム生成機構、即ち生物時計の分子機構はこれらのペプチドがどうして２４時間に一回変動するのかを解明するという努力の延長上に見えてくるはずである。ソマトスタチンのmRNAの解析もその方向の努力であったがこの結果は遺伝子からmRNAを合成する率を制御する所から２４時間の周期性が由来しているという結論であった。つまり何かのタンパクが転写因子として働き、一日のある時は遺伝子からの転写を強く促進し別の時には余り働かないといったことが想像される。勿論これがリズム生成機構の一部だと考えるには未だ早計で、これも時計に制御されている“時計の針”にすぎないのかもしれない。 ９．光によって動くペプチド 視交叉上核の腹外側部ではVIPとGRPが合成されている。この２つのペプチドの量を視交叉上核で測定すると動物が恒暗条件に置かれている限りは殆ど日周変化を示さないことを見つけた１７）。これは恒暗条件下で視交叉上核の内部にある細胞はどれも電気活動に明らかな日周変化を示しているという多くの人に信じられている仮説と必ずしも一致していない。今の考えではVIPを生産する視交叉上核の細胞も電気活動は日周変化していることになっている。それではなぜVIPの量が変動していないのか、これまた大きな疑問として残されている。 VIPのレベルが日周変化しないことは、生物時計機構の影響を受けていないこと、それより上流域にあってVIPの方がリズム生成機構に作用することを意味している。 VIPとGRPが果たしている役割を示唆する事実は動物を明暗環境下においた時のこれらのペプチド量の変動の測定から得られた。明暗環境下ではVIPもGRPも有意の日周変動を示した。その変化の方向は逆でVIPは明るい期間に減少しGRPは暗い期間に増加する。このことから腹内側部にある２つのペプチド（VIPとGRP）は外界の明暗を視交叉上核にあるリズム生成機構に伝達する役割を果たしている可能性が考えられる。恒暗条件ではVIPもGRPも一定なのは、外界の明暗環境の変化を伝える為には必要な性質であったのである。またこの結果は腹外側部の細胞は背内側部の細胞とは何か別の機能を分担している可能性を示している。 １０． 生物時計を構成する分子へ 既に述べてきたように私達はサーカディアンリズムの約２４時間周期の振動を作り出す脳内メカニズムを明らかにしようと努力してきた。今はこのメカニズムの一部である分子を同定するための第一歩としてペプチドとそのmRNAに日周変動があるかどうかを検討している。この結果はリズム生成機構がVIPとGRPより下流側でソマトスタチンmRNAより上流側にあることを示している。 我々が見たのは組織中のペプチドの含量なので、これがそのペプチドのもつ働きの全部を表しているわけではない。ペプチドの働きの別の面、例えば放出量とか受容体との結合能とかを検討すれば別の機能が見えてくる可能性はある。従ってペプチド含量の測定だけではそのペプチドを合成する細胞の働きの全体像を理解することはできない。このことは常に考えておかなければならないことで、さらに実験を積み重ねなければならないことは明らかである。 生物時計の分子メカニズムが１つの分子に担われているとは誰も考えていない。色々な手掛りを推測しながら研究を続け、いくつかの可能性のある分子が発見されれば本当におもしろい問題である”どうして生物が約２４時間周期を作っているのか”、を分子レベルで解き明かすことができるにちがいない。 まとめ 生物の昼と夜は脳の視床下部視交叉上核の中で作られる。その中でもVIP,GRPを含む細胞の影響が伝えられる下流側で、AVPやSSを含む細胞の上流側にこの生物の時計が存在している。この両端の距離を更に縮めて、脳の中の時計が分子レベルで明らかにされるのもそう遠くはない。 ［文献］ 1. Halberg, F. 1986. Chronobiology, A science in tune with the rhythms of life. Bolger Publications. 2. Dethlefsen, U. & Repges, R. 1985. Ein neues Therapieprinzip beinachtlichem asthma. Med. Klin 80: 44-47. 3. Moore-Ede, M.C., Sulzman, F.M. & Fuller, C.A. 1982. The clocks that time us. Harvard Univ Press. 4. 千葉喜彦1975. 生物時計 岩波書店 5. Kleitman, N. & Engelmann, Th.G. 1953. J. appl. Physiol. 6: 269-282. 6. 千葉喜彦, 高橋清久編 1991. 時間生物学ハンドブック 朝倉書店 7. 井上慎一 1987 生体リズムの生理学; 哺乳類、新生理科学大系第13巻（鳥居鎮男・川村浩編）医学書院: 47-58. 8. Inouye, S.-I.T. and Kawamura, H. 1979. Persistence of circadian rhythmicity in a mammalian hypothalamic 'island' containing the suprachiasmatic nucleus, Pro N.A.S. USA 76: 5962-5966. 9. Inouye, S.-I.T. and Kawamura, H. 1983. Does ventromedial hypothalamic nucleus contain self-sustained circadian oscillator associated with food? Brain Res., 279: 53-63. 10 .Inouye, S.-I.T. and Kawamura, H. 1982. Chracteristics of a circadian pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. J. comp. Physiol. 146: 153-160, 1982. 11. Tominaga, K., Shinohara, K., Otori,Y. and Inouye, S.-I.T. 1994. Organotypic slice culture of the suprachiasmatic nucleus. Neuroscience, 59: 1025-1042. 12. Card, T.P., Fitzpatrick-McElligott, S., Gozes, I. and Baldino, F. 1988. Localization of vasopressin, vasoactive intestinal peptide, peptide histidine isoleucine and somatostatin mRNA in rat suprachiasmatic nucleus. Cell Tissue Res. 252: 307-315. 13. Tominaga, K.,Shinohara, K.,Otori,Y., Fukuhara, C. and Inouye, S.-I.T. 1992. Circadian rhythms in vasopressin content in the suprachiasmatic nucleus of the rat. NeuroReport, 3: 809-812. 14. Shinohara, K., Isobe, Y., Takeuchi, J. and Inouye, S.-I.T. 1991. Circadian rhythms of somatostatin-immunoreactivity in the suprachiasmatic nucleus of the rat. Neurosci Lett., 129: 59-62. 15. Takeuchi, J., Nagasaki, H., Shinohara, K. and Inouye, S.-I.T. 1992. A circadian rhythm of somatostatin messenger RNA levels, but not of vasoactive intestinal polypeptide/peptide histidine isoleucine messenger RNA levels in rat suprachiasmatic nucleus, Mol. Cell. Neurosci. 3: 29-35 16. 井上慎一, 篠原一之, 冨永恵子, 福原千秋, 徳増亜古, 1991 視交叉上核細胞の日周リズム. 生体の科学. 42: 589-595. 17. Shinohara, K., Tominaga, K., Isobe, Y. and Inouye, S.-I.T. 1992. Photic regulation of peptides located in the ventrolateral subdivision of the suprachiasmatic nucleus of the rat: daily variations of vasoactive intestinal polypeptide, gastrin releasing peptide and neuropeptide Y. J. Neurosci., 13: 793-800.